Nasz serwis wykorzystuje pliki cookies. Możesz je wyłączyć w ustawieniach przeglądarki. Dalsze korzystanie z witryny bez zmiany ustawień oznacza wyrażenie zgody na korzystanie z plików cookies.

rozumiem i zgadzam się
Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna WWW.TOCZEN.PL
"systemic lupus erythematosus"
 
 Lupus ChatLupus chat  FAQFAQ   SzukajSzukaj   UżytkownicyUżytkownicy   GrupyGrupy   RejestracjaRejestracja 
 ProfilProfil   Zaloguj się, by sprawdzić wiadomościZaloguj się, by sprawdzić wiadomości   ZalogujZaloguj 

Ocena wiarygodności oznaczania niektórych typów swoistości..

 
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna -> Doniesienia Medyczne
Zobacz poprzedni temat :: Zobacz następny temat  
Autor Wiadomość
awania
Master butterfly
Master butterfly


Dołączył: 14 Kwi 2010
Posty: 1119
Skąd: polska

PostWysłany: Wto Sty 11, 2011 11:09 pm    Temat postu: Ocena wiarygodności oznaczania niektórych typów swoistości.. Odpowiedz z cytatem

w poszukiwaniu informacji trafiłam:

Artykuł oryginalny

Ocena wiarygodności oznaczania niektórych typów swoistości przeciwciał przeciwjądrowych

Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna Pyka
Rematologia 2009; 47,6: 311-318

Wstęp
W toczniu rumieniowatym układowym (TRU) występuje ponad 30 autoprzeciwciał o znanej swoistości, przy czym do kryteriów diagnostycznych TRU włączone są przeciwciała ANA oznaczane metodą IIF na komórkach Hep-2 (jako test skryningowy) oraz dwie swoistości przeciwciał: przeciwciała dla antygenu Sm i przeciwciała dla natywnego DNA (dsDNA) [1, 2]. Przeciwciała anty-Sm i anty-dsDNA charakteryzują się wysoką swoistością w stosunku do TRU, ale w przypadku przeciwciał anty-Sm częstość ich występowania jest mała (rzędu 15–30%), a w przypadku przeciwciał dla dsDNA (częstość występowania 60–70%) ich niewątpliwą wartość diagnostyczną obniżają problemy związane z utrzymaniem „natywności” DNA w stosowanych testach oraz istotne różnice w czułości stosowanych testów [3, 4]. Ponadto, zmienia się ich powinowactwo (oraz widność) w przebiegu zaostrzenia w TRU. Dodatkowym problemem jest obecność w surowicach pacjentów z TRU przeciwciał o niskiej awidności rozpoznających jednoniciowe DNA (ssDNA), które występują także w wielu innych układowych chorobach tkanki łącznej [5, 6]. Te dwie populacje przeciwciał anty-DNA mają różny epitop docelowy, którym dla przeciwciał anty-dsDNA jest wyeksponowany w dsDNA szkielet fosfo-cukrowy, a dla przeciwciał anty-ssDNA są reszty zasad purynowych i pirymidynowych [7].
Podobnie jak struktura drugorzędowa dsDNA, a właściwie trudności z jej utrzymaniem, jest problemem w konstruowaniu testów, tak samo konformacja antygenu ssDNA może przypominać fragmentami strukturę (konformację) antygenu dsDNA – poprzez tworzenie (zwłaszcza na obu końcach antygenu ssDNA) podwójnie zapętlonych fragmentów, przypominających strukturę dsDNA, tzw. heterodupleksów [5, 8]. Na dodatek antygeny RNA, zwłaszcza występujące w kompleksach z białkami (np. RNP, Sm czy SSA i SSB), również zawierają fragmenty dwuniciowe, z wyeksponowanym szkieletem fosfo-cukrowym, analogicznie jak w dsDNA [1, 2, 9]. Jeśli zatem budowa antygenu (dsDNA) stosowanego do konstruowania testów jest tak trudna do standaryzacji, to nie dziwią istotne różnice w wartości testów (ich czułości i wiarygodności).
Jednakże, z uwagi na wartość diagnostyczną przeciwciał dla dsDNA (wysoko swoiste „markery” w TRU) oraz ww. trudności techniczne w standaryzacji testów do oznaczania przeciwciał anty-dsDNA, a skutkujące istotnymi różnicami w częstości wykrywania tych autoprzeciwciał przez różne laboratoria, np. w pracach standaryzacyjnych w ramach European Consensus Study on Autoantibodies (ECSA) i ogólnopolskiego grantu pt. „Opracowanie i wdrożenie wysokospecjalistycznych procedur diagnostycznych w chorobach o podłożu immunologicznym” (nr PBZ KBN 119/PO5/2005) podjęto próbę ustalenia dodatkowych parametrów zwiększających wiarygodność oznaczania przeciwciał anty-dsDNA [10–12].
Bezpośrednim bodźcem do wykonania pracy były rozbieżności pomiędzy typem ANA uzyskiwanym w teście IIF-Hep-2 a wykrywanymi przeciwciałami dla dsDNA różnymi testami stosowanymi w diagnostyce tych auto-przeciwciał.


Materiał i metody
Badania wykonano na surowicach chorych z układowymi chorobami tkanki łącznej pochodzących z klinik Instytutu Reumatologii, skierowanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii w celu oznaczenia obecności przeciwciał dla dsDNA.
Przedmiotem szczegółowego rozpracowania było 9 surowic z ww. grupy ok. 80 surowic, co stanowi 11,5% całości, w których stwierdzano podstawową niezgodność typu świecenia ANA uzyskiwanego metodą IIF na komórkach Hep-2, np. przy mianie ANA 1/640 typu plamistego uzyskiwano w metodzie ELISA wysokie poziomy przeciwciał dla dsDNA lub odwrotnie – przy mianie ANA 1/10240 o typie homogenno-plamistym brak było przeciwciał dla dsDNA.
W celu wyjaśnienia powyższych fenomenów wykonano następujące oznaczenia:
• poziomy przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) metodą IIF na komórkach Hep-2 (firma Euroimmun) oraz neutralizacja odczynu ANA IIF preparatami kwasów nukleinowych (ds i ssDNA i RNA firmy Sigma),
• poziomy przeciwciał dla dsDNA dwoma typami testów ELISA (I i II) i Western-blotting oraz immunofluorescencyjnym testem z zastosowaniem utrwalonych preparatów pierwotniaka Crithidia luciliae (CLIFT),
• poziomy przeciwciał dla denaturowanego DNA (ssDNA) – testem ELISA firmy Biomedica,
• poziomy przeciwciał dla kardiolipiny – testem ELISA firmy Biomedica.
Wykonano także neutralizację wyżej opisanych testów do oznaczania przeciwciał dla dsDNA preparatami: dsDNA, ssDNA i preparatem RNA.
Awidność przeciwciał dla dsDNA oznaczano metodą wg Thomasa i wsp. [13], stosując do elucji z frakcji stałej (w metodzie ELISA i Western-blotting) 8M mocznik, natomiast awidność przeciwciał wyrażano, stosując tzw. indeks awidności (avidity index – AI) [13]. Wysoko oczyszczone (metodą chromatografii powinowactwa) przeciwciała dla dsDNA i kardiolipiny uzyskiwano, stosując opłaszczoną odpowiednim antygenem nitrocelulozę (NC) wg metody Gershoniego i wsp. [14].



Wyniki
W celu wyjaśnienia „kontrowersji” dotyczących obecności przeciwciał dla dsDNA w surowicach, w których typ świecenia ANA-IIF niekoniecznie wskazywałby na obecność przeciwciał dla natywnego DNA, wykonano w pierwszym etapie porównanie wartości oznaczeń przeciwciał dla ww. dsDNA czterema różnymi typami testów (2 typy testu ELISA i Western-blotting oraz test z zastosowaniem pierwotniaka Crithidia luciliae na 9 wybranych (z 78 surowic) surowicach – takich, w których wystąpiła wyżej opisana niezgodność typu ANA z poziomami przeciwciał dla dsDNA. Oznaczano także przeciwciała dla ssDNA zwykle niebrane pod uwagę w diagnostyce TRU, ale w przypadku wyżej opisanych 9 surowic uwzględniono je z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, z uwagi na charakter (typ) uszkodzeń tkanek/narządów występujących w TRU, po drugie, z powodu podnoszonych w różnych pracach uzasadnionych wątpliwości dotyczących natywności cząsteczek DNA (występujących fragmentów jednoniciowych w części dwuniciowej) [5, 15]. Wykonano także neutralizację surowic anty-dsDNA-pozytywnych preparatami dsDNA, ssDNA i RNA. Konieczne także okazało się oznaczenie przeciwciał antykardiolipinowych (aCl), ponieważ już wcześniej stwierdzano wrażliwość testów ELISA aCl na neutralizację różnymi preparatami kwasów nukleinowych [16, 17]. Wyniki ww. testów przedstawiono w tabeli I. Średnio w 72% (6/9 w teście ELISA I i 7/9 w teście ELISA II) uzyskano w teście ELISA wyniki dodatnie poziomów przeciwciał dla dsDNA słabo skorelowane z mianem ANA, co oznacza, że w większości surowic o wyższym poziomie ANA (niezależnie od typu świecenia) uzyskano wyższe rezultaty oznaczeń poziomów przeciwciał dla dsDNA. Całkowitą zgodność „jakościową” poziomów przeciwciał anty-dsDNA w czterech wyżej opisanych w metodyce testach uzyskano w 4/9 badanych surowicach, co stanowi tylko 44%, częściowa zaś zgodność najczęściej dotyczyła porównywalnych 2 testów ELISA. W celu wyjaśnienia wyżej opisanych sprzeczności pomiędzy typem ANA a występowaniem przeciwciał anty-dsDNA wykonano test neutralizacji odczynów ANA-IIF oraz ELISA (dla wyżej opisanych 9 surowic) preparatami natywnego i denaturowanego DNA oraz preparatem RNA.
Wyniki neutralizacji przedstawiono w tabeli I oraz na rycinie 1. We wszystkich 9 surowicach (100%) uzyskano całkowitą neutralizację odczynu ANA-IIF ELISA preparatami dsDNA i ssDNA oraz częściową dla RNA. Niespodziewanie uzyskano także neutralizację preparatami oczyszczonego RNA, dlatego dokonano precyzyjnej oceny dawek poszczególnych preparatów zastosowanych do neutralizacji, niezbędnych do uzyskania neutralizacji odczynu ELISA stosowanego do oznaczania przeciwciał anty-DNA. Okazało się, że preparaty dsDNA i ssDNA neutralizują wyżej opisany odczyn już przy dawkach rzędu < 1 mg/ml, natomiast preparaty wysoko oczyszczone RNA neutralizowały odczyn ELISA-anty-dsDNA w dawkach rzędu 10 mg/ml lub powyżej tej wartości, co może wskazywać, że mamy tu do czynienia z 2 różnymi typami epitopów, a neutralizacja tak dużymi dawkami jest wynikiem obecności w RNA zanieczyszczeń DNA.
Należało zatem rozstrzygnąć kwestię porównywalnej skuteczności (w neutralizacji testu ELISA) preparatu dsDNA i ssDNA – czy jest ona wynikiem obecności w czystych dsDNA fragmentach jednoniciowych, czy też rezultatem obecności w surowicach przeciwciał o zróżnicowanych swoistościach względem bogatej epitopowo cząsteczki DNA, co zostało w skrócie omówione we wstępie.
Jest to tym bardziej istotne, że we wszystkich surowicach (100%) stwierdzano umiarkowane lub wysokie poziomy przeciwciał anty-ssDNA, a w 66% obecność (krzyżowo reagujących z dsDNA) przeciwciał dla kardiolipiny (aCl).
W celu potwierdzenia, czy rzeczywiście mamy tu do czynienia z przeciwciałami anty-dsDNA, które są przeciwciałami „markerowymi” TRU, należało znaleźć parametr różnicujący pule przeciwciał anty-DNA. Ponieważ modyfikacja metodami chemicznymi wysoko czystych dsDNA może prowadzić do denaturacji i ew. fragmentacji cząsteczek, wykonano oznaczenie awidności przeciwciał dla dsDNA i ssDNA metodą ELISA [13], wskazujących wzrost zarówno poziomów, jak i powinowactwa, a także awidności przeciwciał anty-dsDNA w trakcie zaostrzenia procesu podstawowego w TRU [18]. We wszystkich 9 przypadkach (100%) uzyskano dla przeciwciał anty-dsDNA wskaźnik AI poniżej 0,25, co dowodzi, że w tych surowicach dominują przeciwciała o niskiej awidności. Również w przypadku przeciwciał dla ssDNA w większości przypadków AI był niższy lub zbliżony do 0,5, z czego wnioskowano, że pule przeciwciał anty-ds i ssDNA częściowo mogą być tożsame.
Aby ostatecznie i jednoznacznie udowodnić tę tożsamość (lub tylko częściową tożsamość) pul przeciwciał dla DNA wykonano adsorpcję przeciwciał anty-DNA z wybranych surowic metodą „powinowactwa”, stosując następujące wysoko oczyszczone antygeny: ssDNA i kardiolipinę związane z nitrocelulozą wg metody Gershoniego [14]. W uzyskanych metodą affinity wysoko oczyszczonych preparatach immunoglobulin oznaczano reaktywność (metodą ELISA) z antygenem homologicznym (tj. takim, na którym adsorbowano przeciwciało) oraz dwoma pozostałymi.
Wyniki oznaczania swoistości w eluatach z nitrocelulozy przedstawiono na rycinie 3. Wyniki oznaczania swoistości (krzyżowej reaktywności) przeciwciał w eluatach z NC związanej z kardiolipiną i ssDNA wskazują, iż odeluowane metodą affinity (powinowactwa) przeciwciała z obu wyżej opisanych immunosorbentów (NC ze związaną kardiolipiną czy ssDNA) reagują także z 2 po-zostałymi antygenami, czyli przykładowo przeciwciała eluowane z ssDNA związanego z NC reagują także z dsDNA i kardiolipiną. Nie zamieszczono eluatów z NC związanej z dsDNA, gdyż ich obecność wykazano w wielu pracach dotyczących natywności preparatu dsDNA [1, 4, 5]. Jednoczesna analiza AI wykazała, że przeciwciała obecne w eluatach reagujące z antygenami niehomologicznymi wykazywały w 100% niski wskaźnik AI (Ł 0,25), a wskaźnik AI dla przeciwciał reagujących z antygenami homologicznymi był nieznacznie wyższy.


Dyskusja
Jak wykazano powyżej, istnieją zatem co najmniej dwie pule przeciwciał dla DNA, których wzajemne proporcje zmieniają się dynamicznie w przebiegu zaostrzeń procesu podstawowego w TRU, ale zmiana nie dotyczy wyłącznie poziomów, lecz także powinowactwa (awidności), która zwiększa się w trakcie zaostrzenia klinicznego [5, 18]. Proces „estymacji” wartości diagnostycznej przeciwciał dla DNA z samego założenia powinien zatem uwzględniać oznaczanie poziomów dla obu pul przeciwciał (anty-ss i dsDNA) oraz oczywiście także oznaczenie powinowactwa (ewentualnie awidności – co jest technicznie prostsze), gdyż oznaczanie samych tylko poziomów przeciwciał dla obu typów DNA, w dodatku wykonywane punktowo, nie daje pełnej informacji o natężeniu procesów patologicznych, których pośrednim wyrazem jest zmiana (wzrost) poziomów przeciwciał dla dsDNA [18]. W celu pełnego wykorzystania walorów diagnostycznych i prognostycznych przeciwciał dla dsDNA powinno się zatem oznaczać nie tylko poziomy dla ss i dsDNA, ich awidność, ale także dynamikę zmian tych parametrów w czasie – nakładającym się na wielorakie objawy kliniczne [5, 19].
Bogactwo dostępnych komercyjnie testów, różniących się swoistością i czułością, zmusza do dokładniejszego przyjrzenia się źródłom tych różnic, a zatem do przyjrzenia się cząsteczkom antygenu (DNA) stosowanym do konstrukcji testów do oznaczania przeciwciał anty-DNA [20, 21]. Podstawowe wątpliwości dotyczą natywności cząsteczki DNA, tj. występowania w cząsteczce dwuniciowego DNA fragmentów jednoniciowych, co prowadzi do pojawienia się epitopów (zasady) dla przeciwciał dla ssDNA i w konsekwencji oznaczania przeciwciał dla obu typów DNA (ss i ds). Niebezpieczeństwo to zwykle jest omijane poprzez stosowanie fagowych, kolistych cząsteczek dsDNA, np. faga MP2 ewentualnie DNA plazmidowego (np. pNC18) [5].
Przedstawiana praca dotyczy nieco bardziej szczegółowego aspektu wyżej opisanych problemów oznaczania przeciwciał dla DNA, gdyż dotyczy tych 5–10% przypadków, w których występuje ewidentna niezgodność typu ANA (uzyskiwanego metodą IIF na komórkach Hep-2) z wynikami uzyskiwanymi różnymi metodami immunoenzymatycznymi (ELISA, Western-blotting) stosowanymi do oznaczania przeciwciał dla dsDNA. W pierwszym etapie dokonano porównania częstości wykrywania przeciwciał dla dsDNA trzema typami testów (po 2 typy testów ELISA i Western-blotting oraz test CLIFT, ponieważ chodziło o wyeliminowanie znanej z wielu prac zależności, że testy o wysokiej swoistości zwykle są testami o mniejszej czułości [5]. Najwyższą czułość wykrywania przeciwciał anty-dsDNA wykazał test immunoenzymatyczny I (78% wyników dodatnich), co nie jest zaskoczeniem w świetle wyżej cytowanych prac, a zgodność jakościowa porównywanych testów wynosiła średnio 44%. Następnie należało sprawdzić wrażliwość porównywanych testów oraz ANA-IIF w teście neutralizacji surowic preparatami dsDNA, ssDNA i RNA. Skuteczną neutralizację testu ANA-IIF uzyskano w 100% preparatów ssDNA i dsDNA i – co ciekawe – niezależnie od typu ANA (także w przypadku typu plamistego, homogenno-plamistego czy brzeżnego). W przypadku neutralizacji odczynów immunoenzymatycznych okazało się, że preparaty dsDNA i ssDNA neutralizują wyżej opisany odczyn już przy dawkach rzędu < 1 mg/ml, natomiast preparaty wysoko oczyszczone RNA neutralizowały odczyn ELISA-anty-dsDNA w dawkach rzędu 10 mg/ml lub powyżej tej wartości, co może wskazywać, że mamy tu do czynienia z 2 różnymi typami epitopów, a neutralizacja tak dużymi dawkami jest wynikiem obecności w RNA śladowych zanieczyszczeń DNA.
Uzyskane wyniki powinny być interpretowane z niezwykłą ostrożnością, zwłaszcza jeśli się weźmie pod uwagę, że antygen ssDNA może przypominać fragmentami strukturę (konformację) antygenu dsDNA – poprzez tworzenie (zwłaszcza na obu końcach antygenu ssDNA) podwójnie zapętlonych fragmentów, przypominających strukturę dsDNA, tzw. heterodupleksów [5, 8]. Na dodatek antygeny RNA, zwłaszcza występujące w kompleksach z białkami (np. RNP, Sm czy SSA i SSB), również zawierają fragmenty dwuniciowe RNA, z wyeksponowanym szkieletem fosfo-cukrowym, analogicznie jak w dsDNA [1, 2, 9]. Ponieważ neutralizacja dotyczyła tylko surowic przy założeniu, że natywność cząsteczek DNA użytych do konstrukcji testów nie budzi zasadniczej wątpliwości, a wątpliwości dotyczą wyżej opisanych struktur antygenów użytych do neutralizacji, to można wyprowadzić ostrożny wniosek, iż brak różnic w dawce „neutralizacyjnej” pomiędzy ssDNA i dsDNA jest wynikiem częściowej homologii cząsteczek dsDNA i ssDNA. Oznacza to, że cząsteczka dsDNA zawiera fragmenty jednoniciowe, a cząsteczka ssDNA dupleksy (fragmenty dwuniciowe) w takim odsetku, że wpływa to na wynik odczynu neutralizacji [5, 8]. W pracach dotyczących obecności dupleksów w ssDNA na ogół nie jest określone, jaki odsetek struktury ssDNA stanowią ww. dupleksy [5], ustalenie zaś odsetka fragmentów jednoniciowych w dsDNA wymagałoby każdorazowego wytrawiania DNA-azą swoistą dla jednoniciowego DNA (np. tzw. Exo-1 z drożdży) [22], co nie jest do przyjęcia w procedurze diagnostycznej. Procedura neutralizacji nie rozstrzyga więc o proporcjach pul przeciwciał dla dsDNA i ssDNA z wyżej opisanych powodów, a zatem należy powrócić do „pewnego” (wg danych literaturowych) parametru, tj. do oznaczania awidności i na eluowanych metodą powinowactwa z NC opłaszczonej ssDNA i dsDNA oraz kardiolipiny przeciwciałach wykazać, że reagują one ze sobą wzajemnie.
Uzyskany dla obu pul przeciwciał niski AI (< 0,25) oraz fakt, że eluaty ww. antygenów (ss i dsDNA oraz Cl), niezależnie od antygenu, z którego były odeluowane, reagują z dwoma pozostałymi wskazuje na podział puli przeciwciał dla DNA nie na 2, ale na 3 podpule przeciwciał anty-dsDNA o wysokiej i niskiej awidności oraz pule przeciwciał anty-ssDNA o niskiej awidności [1, 5, 6], i co najmniej dodatkowo pulę przeciwciał krzyżowo reagujących (np. aCl) o niskiej awidności.

(pełny tekst: http://www.termedia.pl/Czasopismo/Reumatologia-18/Artykul-14549)
Powrót do góry
Zobacz profil autora Wyślij prywatną wiadomość
ewelina266
Master butterfly
Master butterfly


Dołączył: 13 Mar 2010
Posty: 2800

PostWysłany: Sob Mar 19, 2011 10:11 am    Temat postu: Odpowiedz z cytatem

Artykuł oryginalny
Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowych w surowicach ANA-dodatnich na podstawie analizy poszczególnych swoistości przeciwciał obecnych w krążących kompleksach immunologicznych


Wstęp
W układowych chorobach tkanki łącznej występuje wiele zaburzeń odporności prowadzących do występowania tzw. autoprzeciwciał, czyli przeciwciał skierowanych przeciwko wielu antygenom własnoustrojowym. Szczególnie istotne znaczenie diagnostyczne mają przeciwciała skierowane przeciwko różnym składnikom białkowym i niebiałkowym jądra komórkowego (antygeny jądrowe – dsDNA, ssDNA, histon, DNP, antygen Scl-70, białka centromerowe) oraz antygenom białkowym występującym w cytoplazmie, organellach komórkowych lub w błonie komórkowej [1, 2]. Przeciwciała te, określane zbiorczo jako przeciwciała przeciwjądrowe (PPJ; anti-nuclear antibodies – ANA), włączono do kryteriów diagnostycznych wielu chorób reumatycznych z uwagi na ich markerowy charakter, związek z aktywnością procesu chorobowego oraz swoiste korelacje niektórych z nich z określonymi objawami klinicznymi [1, 3, 4].

Lista metod służących do oznaczania ANA jest niezwykle bogata, choć w ostatnich 10–15 latach obserwuje się tendencję w kierunku stosowania metod immunoenzymatycznych, takich jak ELISA, Western-blotting czy DOT-blotting . Widać też wyraźne zróżnicowanie tych metod – na skriningowe, tj. służące jedynie ustaleniu obecności przeciwciał ANA, i na metody pozwalające ustalić swoistość ANA występujących w surowicy danego chorego [5, 6].

Jednak w ok. 10–25% przypadków surowic pobranych od pacjetów ze schorzeniami reumatycznymi, w których wynik ANA jest dodatni, nie udaje się oznaczyć swoistości auto­przeciwciał i wtedy należy analizować przyczyny seronegatywności. Szczególnym problemem są surowice ANA-dodatnie, w których metodami klasycznymi stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udaje się ustalić swoistości autoprzeciwciała markerowego (np. anty-U1snRNP, anty-Sm, anty-Ro i La itp.). Jedną z przyczyn seronegatywności tych surowic może być kompleksemia.

Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, np. w toczniu, gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom poziomu i awidności autoprzeciwciał [7, 8]. Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia choroby zwykle mogą towarzyszyć dwa zjawiska. Pierwsze z nich to uwalnianie z zajętych narządów lub tkanek do krążenia autoantygenów, drugie – związanie autoprzeciwciał obecnych w krążących kompleksach immunologicznych (KKI). Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem aktywnego procesu destrukcji narządów lub tkanek, a drugi prowadzi do neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich miana w surowicach.

Celem pracy była analiza KKI pod kątem ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych w trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich, w przypadku których klasycznymi metodami stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić swoistości przeciwciał ANA.
Materiał i metody
Badania dotyczyły 588 surowic przekazanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia swoistości ANA. Surowice pochodziły z klinik i polikliniki IR.

W surowicach oznaczano następujące parametry:

• miano i typ świecenia ANA metodą IIF – na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2 (firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą Colorzyme (firmy Immunovision, USA),

• poziom autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland Sp. z o.o.),

• poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA),

• frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp. [9],

• frakcję  z osadów po PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconym siarczanem amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej [10, 11],

• białko we frakcji  i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg Kalckara [12].
Wyniki
W surowicach przysłanych do diagnostyki przeciwciał ANA oznaczano miano i typ świecenia, a następnie – postępując zgodnie ze standardową procedurą – wykonywano typowanie swoistości testem Western-blotting lub typowanie wskazanych przez klinicystę swoistości charakterystycznych (przeciwciał markerowych) dla danej jednostki chorobowej. Test Western-blotting służy do oznaczania następujących autoprzeciwciał: anty-U1snRNP, anty-Sm, anty-Ro (SS-A), anty-La (SS-B) anty-Rib-P, anty-PCNA, anty-CENP-B, anty-Scl-70, anty-Jo-I oraz anty-Hp i dsDNA. Wyżej opisaną standardową procedurę wykonano dla 588 surowic. W przypadku 69 surowic (co stanowi 11,7%) przy dodatnim wyniku ANA (rzędu  1/160) oznaczanie poszczególnych swoistości autoprzeciwciał dało wynik negatywny. W niewielkim odsetku (ok. 19%) spośród tych 69 surowic udało się ustalić swoistość autoprzeciwciał (zgodną z typem świecenia ANA) przy znacznym obniżeniu (z 1/100 do 1/10) roboczego rozcieńczenia surowicy.

Być może wyżej opisaną procedurę, tj. proporcjonalne do miana ANA obniżenie rozcieńczenia roboczego surowic dla metody Western-blotting, można będzie stosować obligatoryjnie w przypadkach, w których podstawowe znaczenie ma wykazanie obecności autoprzeciwciała markerowego, a jego poziom ma na tym etapie znaczenie drugorzędne.

Nie rozstrzygnięto, czy w przypadku tych trudnych surowic mamy do czynienia z rzadkim przeciwciałem, dla którego brakuje antygenu w zastosowanym teście Western-blotting, czy też autoprzeciwciało jest związane w KKI, ale zachowało zdolność wiązania się z antygenami, co najczęściej dotyczy przeciwciał klasy IgM, ale także pozostałych klas – IgG i IgA. W tym celu wykonano oznaczanie swoistości przeciwciał ANA metodą Western-blotting. Wiadomo z doświadczeń z seronegatywnymi surowicami chorych podejrzanych o boreliozę, że osady po PEG-6000 oraz frakcje  z surowic seronegatywnych dla przeciwciał anty-Borrelia burgdorferi dają dodatnie wyniki w teście potwierdzenia Western-blotting stosowanym w przypadku pogłębienia diagnostyki boreliozy ([13] oraz praca przygotowywana do druku).

Na rycinie 1 przedstawiono wyniki testu Western-blotting wykonanego na osadach PEG-6000 w zestawieniu z wynikami uzyskiwanymi na pełnych surowicach (metodą standardową), a na rycinie 2 pokazano częstość występowania autoprzeciwciał w osadach PEG.

W ok. 84% surowic uzyskano wyniki pozytywne testów Western-blotting, przy czym w znacznym odsetku (60/69, tj. 87%) uzyskano więcej niż jedną linię (dla różnych swoistości). Wskazuje to, że prawdopodobnie jest to mieszanina KKI o różnym składzie (różna swoistość autoprzeciwciał oraz różne autoantygeny?). Wśród 133 swoistości przeciwciał oznaczanych w 69 surowicach (przeciętnie ok. 2 na surowicę) przeciwciała dla antygenów chromatynowych (anty-Hp i anty-dsDNA) stanowiły blisko 50% (73 oznaczonych swoistości) wszystkich oznaczanych swoistości, natomiast przeciwciała dla antygenów ENA – 32% (43 oznaczonych swoistości), a pozostałe 14 oznaczanych surowic to tylko 10,5%. Przeciwciała dla antygenów chromatynowych (stanowiące 56% wszystkich oznaczanych swoistości) będą przedmiotem dalszych badań, gdyż prawdopodobnie mamy tu do czynienia ze zjawiskiem krzyżowej reaktywności przeciwciał (anty-ssDNA i dsDNA, anty-PL, anty-NuHi, anty-histon i ewentualnie anty-HMG i anty- -uQ). Chcąc wstępnie zróżnicować i scharakteryzować budowę KKI, określono za pomocą surowic anty-Fc i anty-(Fab)2-IgG orientację i lokalizację autoprzeciwciał występujących w danym typie KKI – wykrywanych metodą Western-blotting. Bazowano na opublikowanych danych dotyczących klas i podklas autoprzeciwciał o określonych swoistościach [14]. Wyniki wyżej opisanej analizy dla wybranych surowic przedstawiono na rycinie 3 oraz w tabeli I.

W większości badanych tą metodą surowic (72%) uzyskano pozytywną reakcję, tj. osłabienie linii po dodaniu do osadów PEG surowic anty-F(ab)2-IgG oraz tylko w ok. 30% osłabienie reakcji po surowicach anty-Fc-IgG. Efekt był niezależny od swoistości wykrywanego autoprzeciwciała, co może wskazywać na powierzchniową lokalizację tych autoprzeciwciał. Zróżnicowanie efektów wyżej opisanego eksperymentu dla poszczególnych swoistości nie zostało wykonane dla wszystkich surowic z powodu braku materiału, ale było na tyle charakterys­tyczne, że pozwalało stwierdzić, iż mamy do czynienia z więcej niż jednym typem KKI.
Dyskusja
Z masywną kompleksemią mamy do czynienia na ogół w aktywnej fazie choroby, gdy dochodzi do destrukcji komórek, ewentualnie tkanek zajętych narządów, np. w przebiegu zaostrzenia tocznia rumieniowatego układowego, gdzie jednocześnie ze wzrostem OB, obniżeniem poziomu dopełniacza, zwiększa się także poziom KKI. W KKI związane są autoprzeciwciała [7, 15]. Może to paradoksalnie doprowadzić do sytuacji, w której w okresie aktywności choroby będzie obniżał się poziom autoprzeciwciał markerowych do wartości nieoznaczalnej w stosowanych standardowo metodach.

Jeśli weźmiemy pod uwagę częstość występowania podstawowych autoprzeciwciał włączonych do kryteriów klasyfikacyjnych poszczególnych jednostek chorobowych (opublikowanych w ciągu ostatnich 20 lat) oraz przeanalizujemy możliwe przyczyny seronegatywności surowic w układowych chorobach tkanki łącznej, to hipoteza ta nabiera realnych podstaw [16]. Przykładowo w toczniu rumieniowatym układowym jedno z dwóch podstawowych autoprzeciwciał markerowych (poza przeciwciałami dla dsDNA) – przeciwciała anty-Sm występują w zaledwie 15–30% przypadków tocznia [1, 2, 17]. Także inne autoprzeciwciała markerowe występują w zdiagnozowanych przypadkach układowych chorób tkanki łącznej, np. przeciwciała anty-Scl-70 w ok. 30%, przeciwciała anty-Jo-I w > 20% i przeciwciała anty-Pm- -Scl w > 10%. Nawet w przypadku autoprzeciwciał o stosunkowo wysokiej częstości występowania, np. przeciwciał anty-SSA, anty-CCP, margines seronegatywności sięga 20–30% [18, 19]. Część pacjentów z powodu restrykcji odpowiedzi przeciwciałowej zależnej od haplotypu HLA nie syntetyzuje określonych swoistości, ponieważ jest niewrażliwa na określone sekwencje peptydowe prezentowane komórkom układu odpornościowego [20, 21]. Te 12% surowic (ANA-dodatnich o nieustalonej swoistości) staje się bardzo ważne w indywidualnych przypadkach chorych, u których pozwalają one ustalić rozpoznanie i wdrożyć właściwe leczenie. Jest to ważne również z powodu konieczności przeprowadzenia szybkiej diagnostyki (zarówno klinicznej, jak i laboratoryjnej).

Słuszność założenia, że przynajmniej część autoprzeciwciał markerowych występuje w postaci związanej w KKI, jeśli nie liczyć autoprzeciwciał związanych w tkankach, potwierdza wysoki odsetek występowania KKI w surowicach ANA(+) o nieustalonej swoistości oraz koreluje z mianami ANA tych surowic.

Wyniki oznaczania swoistości wykonane testami Western-blotting i ELISA wykonane na osadach PEG-6000 w pełni potwierdziły słuszność naszych oczekiwań opartych na doświadczeniach z seronegatywnymi surowicami (od chorych z podejrzeniem boreliozy), że osady po PEG-6000 oraz frakcje  z surowic seronegatywnych dla przeciwciał anty-Borrelia burgdorferi dają dodatnie wyniki w teście potwierdzenia Western-blotting stosowanym w przypadku podejrzenia o boreliozę [13].

Uzyskane wyniki pozwalają na konstatację (w pełni uzasadnioną), że w krążeniu występuje więcej niż jeden typ KKI, gdyż swoistości pojawiające się w osadach PEG-6000 z surowic nie mogą być zlokalizowane na jednej cząsteczce antygenu. Przykładowo w niektórych osadach PEG pojawiają się swoistości, takie jak anty-histon, anty-SSA i anty-SSB, anty-U1snRNP. Może to mieć znaczenie w przypadku zespołu nakładania, w którym występuje nakładanie się objawów klinicznych różnych chorób układowych oraz obecne są różne swoistości autoprzeciwciał [22].

Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się aktywności przeciwciałowej po precypitacji glikolem polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Da jest efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu, czy jest spowodowane zmianą konformacji poszczególnych białek wchodzących w skład KKI – będzie to przedmiotem dalszych badań w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii IR.

Wszystkie wyżej opisane doświadczenia mające na celu wyjaśnienie przyczyn seronegatywności powinny być uzupełnione analizą składu antygenowego metodami antygenowo-swoistymi, tj. takimi, które pozwalają ustalić rzeczywisty skład antygenów występujących w KKI [23]. Potwierdziłoby to w sposób oczywisty wiarygodność zaproponowanych przez autorów oznaczeń. Dodatkowo ze względu na prostotę metodyczną tego podejścia do analizy składu KKI, umożliwiłoby wprowadzenie tej metodyki do diagnozowania „trudnych” z punktu widzenia analitycznego surowic, co też będzie przedmiotem dalszych badań.


Praca częściowo sfinansowana z grantu PBZ-KBN-119/PO/05/2005.
_________________
_________________
Zbieram siły do walki.
Powrót do góry
Zobacz profil autora Wyślij prywatną wiadomość
Wyświetl posty z ostatnich:   
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna -> Doniesienia Medyczne Wszystkie czasy w strefie CET (Europa)
Strona 1 z 1

 
Skocz do:  
Nie możesz pisać nowych tematów
Nie możesz odpowiadać w tematach
Nie możesz zmieniać swoich postów
Nie możesz usuwać swoich postów
Nie możesz głosować w ankietach


Powered by PhPBB © 2001, 2002 phpBB Group