Nasz serwis wykorzystuje pliki cookies. Możesz je wyłączyć w ustawieniach przeglądarki. Dalsze korzystanie z witryny bez zmiany ustawień oznacza wyrażenie zgody na korzystanie z plików cookies.

rozumiem i zgadzam się
Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna WWW.TOCZEN.PL
"systemic lupus erythematosus"
 
 Lupus ChatLupus chat  FAQFAQ   SzukajSzukaj   UżytkownicyUżytkownicy   GrupyGrupy   RejestracjaRejestracja 
 ProfilProfil   Zaloguj się, by sprawdzić wiadomościZaloguj się, by sprawdzić wiadomości   ZalogujZaloguj 

Nowe testy serologiczne w diagnostyce reumatologicznej

 
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna -> Doniesienia Medyczne
Zobacz poprzedni temat :: Zobacz następny temat  
Autor Wiadomość
Robert
Moderator
Moderator


Dołączył: 02 Lut 2006
Posty: 6881
Skąd: Toruń / Warszawa

PostWysłany: Pon Gru 31, 2007 10:58 pm    Temat postu: Nowe testy serologiczne w diagnostyce reumatologicznej Odpowiedz z cytatem

Jako, iż jest to temat, który można podczepić pod wiele in. dot. badań i testów, tym razem chyba utworzę wątek odrębny żeby gdzieś nie przepadło bez wieści (mimo, iż jest wyszukiwarka Wink )

Źródło;

Reumatologia 2007; 45, 6: 369–373

autor: Paweł Hrycaj

Nowe testy serologiczne w diagnostyce reumatologicznej


Wstęp

Hipokrates uważał, że dolegliwości i choroby reumatyczne powstają w wyniku zaburzeń spływu śluzu z mózgu do nosa. Chociaż ta koncepcja rozwoju reumatyzmu nie jest już aktualna, to jednak była pierwszą hipotezą, która zwróciła uwagę na rolę czynników humoralnych w patogenezie chorób reumatycznych. Początek współczesnej serologii i immunodiagnostyki chorób reumatycznych przypada na czasy znacznie późniejsze. Rozwój biochemii pozwolił na poznanie składu białkowego osocza [1]. Z czasem odkryto, że niektóre białka obecne we frakcji globulinowej osocza (przeciwciała) pełnią funkcję ochronną dla ustroju i mają właściwość wiązania obcych cząsteczek – antygenów. W stanach chorobowych mogą pojawiać się jednak nieprawidłowe przeciwciała (autoprzeciwciała), które mają właściwość rozpoznawania własnych antygenów.
Pierwszym autoprzeciwciałem wykrytym u chorych na schorzenie reumatyczne (i równocześnie pierwszym autoprzeciwciałem wykrytym u człowieka) był czynnik reumatoidalny (rheumatoid factor – RF), opisany po raz pierwszy przez Waalera u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS). Chociaż u chorych na RZS opisano występowanie przeciwciał przeciwko wielu autoantygenom, jedynie 3 autoprzeciwciała – RF, przeciwciała przeciw cytrulinowanym białkom/peptydom (anti-cyclic citrullinated peptide – aCCP), przeciwciała przeciw białku wiążącemu immunoglobulinę (BiP) – mają wystarczającą czułość i swoistość, aby mogły być zastosowane dla potrzeb praktycznej immunodiagnostyki RZS, a jedynie dwa pierwsze takie zastosowanie znalazły [2].

Przeciwciała przeciw cyklicznym cytrulinowanym peptydom

Chociaż aCCP weszły do rutynowej diagnostyki reumatologicznej zaledwie kilka lat temu, to historia ich odkrycia i pierwszych zastosowań ma już ponad 40 lat. W 1964 r. Nienhuis i Mandema opisali nowe autoprzeciwciało (nazwane przez nich czynnikiem przeciwokołojądrowym – antiperinuclear factor – APF), wykrywane u chorych na RZS za pomocą techniki immunofluorescencji pośredniej na podstawie charakterystycznego świecenia ziarnistości okołojądowych komórek nabłonka błony śluzowej jamy ustnej [3]. Piętnaście lat później Young i wsp. opisali inne przeciwciała, które w metodzie pośredniej immunofluorescencji były wykrywane na podstawie świecenia zewnętrznych warstw nabłonka przełyku szczurzego [4]. Ponieważ początkowo sądzono, że antygenem dla tych przeciwciał jest keratyna, przeciwciała nazwano antykeratynowymi (antikeratin antibodies – AKA). Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem technik adsorpcyjnych i enzymatycznych nie powierdziły postulowanej swoistości przeciwciał – wykazano, że AKA reagują z kilkoma antygenami o masach cząsteczkowych 210 kD, 90–120 kD i 60–130 kD oraz ludzką filagryną nabłonkową (z czasem AKA zaczęto nazywać przeciwciałami antyfilagrynowymi). W 1995 r. Sebbag i wsp. wykazali, że APF i AKA/przeciwciała antyfilagrynowe są w istocie identyczne (ryc. 1.) [5].
Należy podkreślić, że AKA/przeciwciała antyfilagrynowe nie zrobiły wielkiej „kariery” jako rutynowy test w diagnostyce zapaleń stawów.
W dalszych badaniach wykazano, że za wiązanie APF/AKA/przeciwciał antyfilagrynowych odpowiada obecność reszt cytrulinowych w cząsteczkach antygenu. Obserwacja ta dała początek poszukiwaniom nowych testów diagnostycznych opartych na cytrulinowanych białkach lub peptydach, które cechowałaby większa czułość, niski koszt i niewielka pracochłonność, poprawiona powtarzalność wyników i łatwość wykonania w warunkach każdego laboratorium. Zastosowanie syntetycznych cyklicznych peptydów zawierających cytrulinę pozwoliło na optymalizację testów. Obecnie stosowane testy wykorzystują cykliczne peptydy drugiej i trzeciej generacji [6].
W metaanalizie przeprowadzonej przez francuskich badaczy wykazano, że aCCP cechuje wysoka swoistość i czułość dla RZS (odpowiednio >95 i 68%). Zaobserwowano także, że aCCP stosunkowo rzadko występują w przebiegu chorób reumatycznych innych niż RZS, takich jak „reumatyzm palindromiczny”, łuszczycowe zapalenie stawów i toczeń rumieniowaty układowy [7].
Z kolei Rantapaa-Dahlqvist i wsp. oceniali dwie grupy szwedzkich krwiodawców, u których po latach rozwinęło się RZS. Obecność aCCP w surowicach chorych z okresu poprzedzającego rozwój choroby pozwalała na predykcję RZS z czułością sięgającą 52% i swoistością 98%. Dla porównania, czułość wyliczona w tej samej grupie dla oznaczeń RF wynosiła tylko 30% [8, 9]. Niedawno Berglin i wsp. wykazali, że obecność shared epitopes w locus HLA-DRB1 i aCCP w surowicy badanych krwiodawców pozwala na wyselekcjonowanie osób, u których w przyszłości rozwinie się RZS [10].
Johansson i wsp. wykazali związek między polimorfizmem genu PTPN22 w pozycji 1858, obecnością aCCP, czynnikiem reumatoidalnym i obecnością shared epitopes w locus DRB1 (HLA-DRB1 *0404 i *0401) a ryzykiem rozwoju RZS [11]. Wykrycie wariantu PTPN22 1858T i aCCP w surowicy chorych pozwalało na przewidywanie rozwoju RZS ze 100-procentową swoistością. Być może połączenie badań serologicznych i immunogenetycznych pozwoli w przyszłości na „przesunięcie” czasu rozpoznania RZS do bardzo wczesnej objawowej fazy choroby, a nawet rozpoznanie choroby przed wystąpieniem pierwszych uchwytnych objawów zapalenia stawów.

Badania serologiczne w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej

Badania serologiczne, w szczególności wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych, stanowią podstawę immunodiagnostyki układowych chorób tkanki łącznej. Chociaż znane i stosowane od lat najważniejsze techniki badawcze (metoda immunofluorescencji pośredniej, metody immunoenzymatyczne, western blot) są ciągle doskonalone w celu poprawienia powtarzalności, czułości i swoistości oznaczeń, to nadal często zdarzają się znaczne różnice w wynikach oznaczeń wykonywanych w różnych ośrodkach diagnostycznych. Fakt ten wskazuje na pilną potrzebę standaryzacji i walidacji oznaczeń.
Podstawową zasadą immunodiagnostyki układowych chorób tkanki łącznej jest odpowiedni dobór testów diagnostycznych opierający się na następujących przesłankach:
1. Badane autoprzeciwciało jest charakterystyczne/patognomoniczne dla danej jednostki chorobowej lub określonej grupy chorób.
2. Miano autoprzeciwciała odzwierciedla aktywność procesu chorobowego.
3. Obecność autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi i/lub profilem zmian narządowych w przebiegu choroby.
4. Obecność autoprzeciwciała ma znaczenie rokownicze w danej jednostce chorobowej.

We współczesnej immunodiagnostyce wykorzystuje się różne metody oznaczeń, z których najpowszechniej używane to metoda immunofluorescencji pośredniej, metody immunoenzymatyczne (ELISA), technika „colorzyme” (metoda immunoperoksydazowa, połączenie metody immunoenzymatycznej z techniką immunofluorescencji pośredniej), techniki line blot, dot blot i western blot.
Pełna immunodiagnostyka obejmuje zwykle 3–4 etapy [12]:
1. Ustalenie, czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała przeciwjądrowe za pomocą czułych testów przeglądowych (najczęściej wykorzystuje się w tym celu metodę immunofluorescencji pośredniej lub immunoenzymatyczną przy użyciu mieszaniny wysoko oczyszczonych antygenów jądrowych).
2. Ustalenie swoistości autoprzeciwciał w surowicach ANA+ (zwykle za pomocą metody immunoenzymatycznej, immunoperoksydazowej, dot blot lub western blot).
3. Sprawdzenie, czy w badanej surowicy znajdują się przeciwciała przeciw podtypom (fine specificities) poszczególnych autoantygenów (np. U1-snRNP – 68 kD, A i C, SSA – 60 kD, SSA – 52 kD), których występowanie koreluje z określonym zespołem objawów klinicznych. Niekiedy na tym etapie potrzebne jest także rozszerzenie diagnostyki o wykrywanie przeciwciał przeciw niektórym antygenom cytoplazmatycznym, takim jak rybosomalne białko P, Jo-1 czy białka cytoszkieletu.
4. W kilku procentach przypadków konieczna może być dodatkowa immunodiagnostyka, z wykorzystaniem bardziej złożonych technik, o ile nie udało się ustalić swoistości przeciwciał w surowicach ANA+ za pomocą standardowych procedur diagnostycznych.

W surowicach ANA+ pewną pomocą w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał może być ocena typu świecenia jąder komórkowych. Opisane wyżej wieloetapowe procedury są czasochłonne i pracochłonne oraz dość kosztowne, z tego względu poszukuje się dziś nowych metod diagnostycznych, które mogłyby przyspieszyć i zautomatyzować immunodiagnostykę chorób układowych tkanki łącznej. Rozwiązanie tego problemu może przynieść wykorzystanie metod i zasad proteomiki.

Proteomika – przyszłość immunodiagnostyki chorób reumatycznych?

Proteomika jest dziedziną nauki zajmującą się badaniem białek – ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi. Termin ten jest zwykle używany do określenia badań białek prowadzonych na dużą skalę (analizy całych proteomów). Należy podkreślić, że proteomika jest dziedziną szerszą i bardziej złożoną niż genomika, ponieważ genom zmienia się w stosunkowo małym stopniu w porównaniu z białkami, których skład zmienia się nieustannie wskutek działania czynników wewnątrzpochodnych i środowiskowych.
Liczba genów kodujących białka u człowieka jest znacznie mniejsza niż całkowita liczba białek w ludzkim proteomie (odpowiednio 22 tys. i ok. 400 tys.). Przypuszcza się, że przyczynami tej różnicy są procesy alternatywnego splicingu oraz modyfikacje potranslacyjne. Badanie genomu jest zatem niewystarczające, aby w pełni scharakteryzować różnorodność proteomu [13–18].
W uproszczeniu można powiedzieć, że zastosowanie technik proteomicznych w immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej sprowadza się do zastosowania technologii pozwalających na jednoczesne wykonanie oznaczeń autoprzeciwciał przeciwko wielu antygenom pochodzenia jądrowego i cytoplazmatycznego, co pozwala określić pełny profil zaburzeń immunologicznych stwierdzanych u danego chorego w pojedynczym oznaczeniu. Najważniejsze zalety takich metod to:
• możliwość pełnej automatyzacji oznaczeń i zmniejszenia ich pracochłonności,
• skrócenie czasu oczekiwania na wynik,
• poprawa powtarzalności i lepsza kontrola jakości oznaczeń,
• poprawa czułości i swoistości oznaczeń pojedynczych autoprzeciwciał poprzez zastosowanie zestawu alternatywnych antygenów (np. zestawu kilkudziesięciu różnych cyklicznych cytrulinowanych peptydów i cytrulinowanych białek, pozwalającego wykryć różne swoistości przeciwciał antycytrulinowych, obecne w surowicach chorych),
• możliwość jednoczesnego oznaczenia przeciwciał o znaczeniu diagnostycznym, różnicowym, predykcyjnym i prognostycznym, co pozwala na uzyskanie pełnej oceny statusu serologicznego u danego pacjenta,
• możliwość automatycznej analizy za pomocą komputerowych systemów wspomagania diagnozy, co umożliwia uzyskanie danych co do prawdopodobieństwa rozpoznania danej choroby w badanym przypadku,
• jednoczesna ocena czynników, które potencjalnie mogą interferować z wynikami oznaczeń (np. obecność RF),
• łatwość kontrolowania zmian w profilu autoprzeciwciał związanych z rozwojem choroby lub zastosowanym leczeniem,
• możliwość prowadzenia badań przesiewowych w populacjach z podwyższonym ryzykiem autoimmunizacji.
Najczęściej stosowane techniki multipleksowe to:
• liniowe techniki immunoblot – pozwalają na jakościową lub półilościową ocenę od kilku do kilkunastu autoprzeciwciał w jednym oznaczeniu; technika wykorzystuje paski nośnika (zwykle nitrocelulozy), z naniesionymi w określonych miejscach wysoko oczyszczonymi antygenami w postaci cienkich linii; sposób przeprowadzenia inkubacji i interpretacji wyników jest zbliżony do powszechnie znanej techniki western blot;
• cytometria przepływowa – pozwala na wykrywanie od kilkunastu do kilkudziesięciu autoprzeciwciał przy użyciu opłaszczonego nośnika, w postaci kulistych mikrocząstek (microbeads) różnej wielkości;
• mikromacierze – technika pozwala na równoczesne oznaczenie nawet do kilkuset autoprzeciwciał na podstawie naniesionych na fazę stałą antygenów tworzących rodzaj macierzy o określonym położeniu poszczególnych swoistości;
• czipy antygenowe (antigen chip) – technologia podobna do techniki mikromacierzy, która dzięki jeszcze większej miniaturyzacji pozwala na jednoczesne oznaczenie jeszcze większej ilości autoprzeciwciał; czip antygenowy powstaje w wyniku naniesienia za pomocą precyzyjnych robotów znikomych ilości antygenów na odpowiednio przygotowaną szklaną płytkę, dzięki czemu możliwe jest wykrywanie olbrzymiej liczby autoprzeciwciał w znikomej ilości materiału biologicznego (ryc. 2.).

Wydaje się, że rosnąca wiedza na temat autoimmunizacji i konieczność oznaczania stale rosnącej liczby autoprzeciwciał w krótkim czasie u dużej liczby chorych będzie skutkować coraz powszechniejszym stosowaniem technik multipleksowych w rutynowej immunodiagnostyce układowych chorób tkanki łącznej.

----------------------------------------
Piśmiennictwo

1. Plebani M. Proteomics: the next revolution in laboratory medicine? Clin Chim Acta 2005; 357: 113-122.
2. Nell VP, Machold KP, Stamm TA, et al. Autoantibody profiling as early diagnostic and prognostic tool for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2005; 64: 1731-1736.
3. Nienhuis RL, Mandema E. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis; the antiperinuclear factor. Ann Rheum Dis 1964; 23: 302-305.
4. Young BJ, Mallya RK, Leslie RD, et al. Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br Med J 1979; 2: 97-99.
5. Sebbag M, Simon M, Vincent C, et al. The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1995; 95: 2672-2679.
6. Mewar D, Wilson AG. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: a review. Biomed Pharmacother 2006; 60: 648-655.
7. Avouac J, Gossec L, Dougados M. Diagnostic and predictive value of anti-cyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 2006; 65: 845-851.
8. Rantapaa-Dahlqvist S, de Jong BA, Berglin E, et al. Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48: 2741-2749.
9. Rantapaa-Dahlqvist S. Diagnostic and prognostic significance of autoanti-bodies in early rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2005; 34: 83-96.
10. Berglin E, Padyukov L, Sundin U, et al. A combination of autoantibodies to cyclic citrullinated peptide (CCP) and HLA-DRB1 locus antigens is strongly associated with future onset of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2004; 6: R303-R308.
11. Johansson M, Arlestig L, Hallmans G, et al. PTPN22 polymorphism and anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in combination strongly predicts future onset of rheumatoid arthritis and has a specificity of 100% for the disease. Arthritis Res Ther 2006; 8: R19.
12. Ząbek J. Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej. Reumatologia 2005; 43: 335-340.
13. Binder SR, Hixson C, Glossenger J. Protein arrays and pattern recognition: new tools to assist in the identification and management of autoimmune disease. Autoimmun Rev 2006; 5: 234-241.
14. Binder SR. Autoantibody detection using multiplex technologies. Lupus 2006; 15: 412-421.
15. Hueber W, Kidd BA, Tomooka BH, et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2005; 52: 2645-2655.
16. Quintana FJ, Merbl Y, Sahar E, et al. Antigen-chip technology for accessing global information about the state of the body. Lupus 2006; 15: 428-430.
17. Robinson WH. Antigen arrays for antibody profiling. Curr Opin Chem Biol 2006; 10: 67-72.
18. Wu T, Mohan C. Proteomics on the diagnostic horizon: lessons from rheumatology. Am J Med Sci 2007; 333: 16-25.


----------------------------------------

I jeszcze jeden przy okazji:

Reumatologia 2007; 45, 6: 321–324

autorzy: Anna Olewicz-Gawlik, Paweł Hrycaj

cały artykuł: Arrow Białka ostrej fazy w chorobach reumatycznych – czy tylko markery?
Powrót do góry
Zobacz profil autora Wyślij prywatną wiadomość
Robert
Moderator
Moderator


Dołączył: 02 Lut 2006
Posty: 6881
Skąd: Toruń / Warszawa

PostWysłany: Pon Kwi 07, 2008 7:25 pm    Temat postu: Odpowiedz z cytatem

Dodatek:

Przewodnik Lekarza 1/2008, 1: 124-128
autor: Irena Zimmermann-Górska

Arrow Postępy w diagnostyce i terapii w reumatologii

Fragment


Postępy w diagnostyce

Badania serologiczne

Przeciwciała przeciw cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi (aCCP). Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest najczęstszą zapalną chorobą stawów. Ostatnio dowiedziono, że szansa zmniejszenia aktywności procesu zapalnego i zmian destrukcyjnych w stawach, do których dochodzi w tej chorobie, wiąże się z jej możliwie wczesnym rozpoznaniem i rozpoczęciem leczenia modyfikującego. Diagnostyka RZS w pierwszych miesiącach procesu zapalnego jest często bardzo trudna i wymaga różnicowania z wieloma innymi chorobami o podłożu immunologicznym, infekcyjnym, nowotworowym lub metabolicznym. Do niedawna wśród badań laboratoryjnych przydatnych w rozpoznawaniu RZS największe znaczenie miało wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko immunoglobulinie G, czynnikowi reumatoidalnemu. Czynnik ten może jednak pojawić się w przebiegu choroby późno, nawet po 6 mies. od momentu wystąpienia pierwszych objawów klinicznych. Przez wiele lat poszukiwano więc innych możliwości diagnostycznych. W 1999 r. wprowadzono test, polegający na oznaczaniu przeciwciał przeciw cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi (aCCP), który później stopniowo doskonalono [1]. Obecnie dodatni wynik testu ELISA II generacji wykrywającego aCCP uważa się za marker wczesnego RZS. Swoistość testu określa się na 95,7%, a jego czułość na 85,1% [2]. Prawidłowy wynik badania aCCP tą metodą to <5 RU/ml. Przeciwciała przeciwfosfolipidowe (aPL). Obecność aPL stanowi kryterium laboratoryjne rozpoznawania zespołu antyfosfolipidowego (APS). Kryteria kliniczne zespołu to zakrzepica, która może wystąpić w naczyniach żylnych, tętniczych i włosowatych w obrębie każdej tkanki i narządu, oraz powtarzająca się utrata ciąży. Zespół ten – opisany po raz pierwszy przed 20 laty – jest wciąż zbyt rzadko rozpoznawany. Jego rozpoznanie pozwala natomiast na odpowiednie leczenie i profilaktykę groźnych dla życia objawów. Do aPL zalicza się antykoagulant toczniowy (LA), przeciwciała antykardiolipinowe należące do immunoglobulin klasy G (IgG) i klasy M (IgM) oraz przeciwciała przeciwko b2-glikoproteinie I (ab2GPI). Przeciwciała te wykrywane są różnymi metodami. W celu wykrycia LA wykonuje się 3 testy – oznaczenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji, czasu krzepnięcia osocza po dodaniu jadu węża Russella lub czasu protrombinowego. Żaden z tych testów nie wykazuje 100-procentowej czułości, dlatego też do wykluczenia LA wskazane jest wykonanie równolegle przynajmniej 2 testów [3]. Pozostałe wymienione wyżej aPL wykrywa się metodami immunoenzymatycznymi (ELISA). Trwają badania mające na celu określenie wartości diagnostycznej oznaczania przeciwciał przeciwko innym aPL. (...)


------------------------------------
Dla zainteresowanych w powyższym artykule są również krótkie informacje nt. terapii dny moczanowej, profilaktyki miażdżycy w przebiegu chorób reumatycznych oraz nt. leków biologicznych.
Powrót do góry
Zobacz profil autora Wyślij prywatną wiadomość
ludmila_07
Master butterfly
Master butterfly


Dołączył: 21 Lis 2007
Posty: 3621

PostWysłany: Pon Kwi 07, 2008 8:35 pm    Temat postu: Odpowiedz z cytatem

ja zaburzałam obraz swojej choroby ,,prawidłowymi " ciążami
choć pierwsza mocna ciąża była jeszcze bez leczenia przeciwazakrzepowego , drugą przeszłam razem z clexane , który to lek brałam ze wzwgledu na ciągłe zapalenie naczyń i robiące się zatory
nikt wtedy tego nie powiązał w jedną całość
_________________
W swojej walce z życiem stań po stronie życia - Franz Kafka

W naszym życiu jak na palecie artysty jest jeden jedyny kolor, który nadaje znaczenie życiu i sztuce - kolor miłości
Mark Chagall
Powrót do góry
Zobacz profil autora Wyślij prywatną wiadomość Wyślij email Numer GG Tlen
Wyświetl posty z ostatnich:   
Napisz nowy temat   Odpowiedz do tematu    Forum WWW.TOCZEN.PL Strona Główna -> Doniesienia Medyczne Wszystkie czasy w strefie CET (Europa)
Strona 1 z 1

 
Skocz do:  
Nie możesz pisać nowych tematów
Nie możesz odpowiadać w tematach
Nie możesz zmieniać swoich postów
Nie możesz usuwać swoich postów
Nie możesz głosować w ankietach


Powered by PhPBB © 2001, 2002 phpBB Group